3 测序技术基础
本章提要
本章围绕测序技术和原始数据展开：先理解不同实验究竟测到了什么，再沿技术发展认识 Sanger 测序与高通量测序、以 Illumina 为代表的第二代测序、MGI，以及 PacBio 与 Nanopore 长读长技术。随后把高通量文库构建与 FASTA/FASTQ 数据存储、质量编码联系起来，学习逐模块阅读 FastQC 报告，掌握去接头、质量裁剪与 seqkit 等常见数据清理操作。通过这些内容，希望你能说明原始数据的来源，读懂质量信息，并解释每一次数据处理的目的。
3.1 不同测序实验究竟测到了什么
不同实验产生的 reads，代表的生物学测量并不相同。
拿到一份测序数据时，最先要回答的问题不是“用什么软件分析”，而是“这份样本里究竟测到了什么分子”。测序仪输出的 reads 形式上都一样——一串 A、T、C、G 和对应的质量值——但它们背后的生物学对象可以完全不同：有的测的是基因组 DNA，有的测的是逆转录后的 mRNA，有的测的是被蛋白质“拉下来”的 DNA 片段，还有的只测外显子区域。如果不清楚 reads 的来源，后面的每一步分析都可能答非所问。
理解一份测序数据，可以从三个问题入手：样本是什么（组织、细胞还是单个细胞）；文库怎么建（片段如何打断、是否逆转录、是否富集特定区域）；测的是哪一段（基因组全序列、外显子、转录本还是结合位点片段）。下表列出本书后续章节会详细分析的常见实验类型。
| 实验类型 | 测到的分子 | 回答的生物学问题 | 详见 |
|---|---|---|---|
| 全基因组测序（WGS） | 基因组 DNA 片段 | 群体与个体变异、基因组组装 | 第 7 章 |
| 全外显子测序（WES） | 富集到的外显子区域 DNA | 罕见病与癌症中的编码区变异 | 第 7 章 |
| 转录组测序（RNA-seq） | mRNA 逆转录成的 cDNA | 基因表达水平与差异表达 | 第 5 章 |
| 单细胞转录组测序 | 单个细胞内的 mRNA | 细胞类型、状态与发育轨迹 | 第 9 章 |
| ChIP-seq | 蛋白质结合的 DNA 片段 | 转录因子或组蛋白的结合位置 | 第 6 章 |
| ATAC-seq | 开放染色质区域的 DNA | 染色质可及性变化 | 第 6 章 |
| 长读长测序 | 长片段 DNA 或 RNA | 结构变异、复杂区域、转录本异构体 | 本章 3.5 节 |
同一个样本采用不同实验，得到的 reads 含义会完全不同；建库方案也会改变数据的偏向和噪声特性。接下来，我们先看这些 reads 是怎样测出来的，再介绍文库构建、数据存储格式与质量评估。
3.2 从 Sanger 到高通量测序
理解每一代测序技术解决了什么问题、又付出了什么代价。
Sanger 测序：双脱氧链终止法
Sanger 法即双脱氧链终止法，是第一代测序技术的代表。它利用 DNA 复制原理，在反应中加入双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）：ddNTP 缺少 3′ 羟基，一旦掺入延伸中的链，反应就无法继续，DNA 链便在对应位置终止。四种 ddNTP 分别反应（或以荧光标记区分）后，依据不同长度的终止片段判断每个位置的碱基类型。
Sanger 测序的读长可达 500—1000 bp，单条序列的准确率很高，至今仍是验证少量序列的“金标准”。它的通量较低，因为每条序列都需要独立反应，再通过电泳分离（早期为凝胶电泳，后来是毛细管电泳），一次能并行处理的序列数量有限。实验室常用它验证质粒、PCR 产物或克隆单条序列；但若用它测一个人类基因组，就需要极其大量的独立反应，成本无法承受。
第二代测序的兴起
第二代测序（Next Generation Sequencing，NGS）的核心突破不是把单条序列读得更准，而是并行化：把亿万条模板片段固定在芯片上同时测序，用“空间换通量”。发展过程中出现过几条技术路线：Roche 454 采用焦磷酸测序，Ion Torrent 用半导体芯片检测合成时释放的氢离子，而 Illumina（源于 Solexa 公司 2006 年发布的 Genome Analyzer）采用荧光可逆终止化学，凭借通量和成本的平衡最终占据主导。我们接触到的很多生物信息学技术，比如 RNA-seq、ChIP-seq、Hi-C 等，都建立在 NGS 之上。
第二代测序的特点是高通量、单碱基成本低，但读长短（通常 50—300 bp）。本章 3.3 节以 Illumina 为例讲解原理，其他短读长平台的思路相近。
机型与通量：随时代变化
分析数据前需要知道它出自什么仪器。Illumina 的机型差不多每三到五年更新一代，单次运行通量从 GA 时代的几十 Gb 增长到如今 NovaSeq X Plus 的 16 Tb——二十年提高了约三个数量级，而读长始终停留在几百 bp。下表按年代列出各时代的代表机型与规格页通量（均为 2×150 等最长读长下的上限口径，实际产出随试剂版本与样本质量浮动）。
| 时代 | 代表机型 | 单次运行通量（规格口径） |
|---|---|---|
| GA 时代（2006—2010） | Genome Analyzer IIx | ~85—95 Gb |
| HiSeq 时代（2011—2017） | HiSeq 2000/2500 | 0.2—1 Tb |
| HiSeq 3000/4000 | 0.75—1.5 Tb | |
| HiSeq X Five/X Ten | 1.6—1.8 Tb | |
| NovaSeq 时代（2017—2022） | NovaSeq 6000（双 S4 流动槽） | ~5—6 Tb |
| NextSeq 550、MiSeq | 15—120 Gb | |
| NovaSeq X 时代（2023 至今） | NovaSeq X / X Plus | ~8 Tb / 16 Tb |
| NextSeq 2000 | 最高 540 Gb |
专利到期与国产测序仪。 Illumina 边合成边测序的核心化学专利（如可逆终止子专利 US 7,541,444 及其同族）在 2022—2024 年间陆续到期。此后国内出现了一批采用 SBS/可逆末端终止化学路线的测序仪企业：真迈生物（SURFSeq 系列，GenoLab M、FASTASeq 300 等机型）、赛陆医疗（Salus Pro，4—600 Gb/run，超高通量的 EVO 可达 1.8 Tb）和赛纳生物（荧光发生 SBS 加纠错编码）等。它们的共同点是数据格式与生信流程和 Illumina 高度兼容，但仪器、芯片与试剂均为自研，与 Illumina 设备互不通用；华大智造则走自有的 DNBSEQ 体系（见 3.4 节），不属于 SBS 兼容路线。这些机型多在 2024—2025 年取得医疗器械注册证并快速进入临床与科研市场。
上表数字是各时代规格页的宣传口径；同一机型换用不同试剂版本，通量区间也会变化。分析具体数据前，应以测序公司或平台提供的实际参数（读长、通量、Q30 比例）为准，不要凭印象套用其他机型的数字。
3.3 Illumina 测序原理
理解接头、索引、双端测序和测序错误如何影响数据。
一些常用基本概念的介绍
- flowcell（流动槽）是测序反应发生的位置；lane 数目随仪器和流动槽型号变化
- lane（泳道）是流动槽内的反应区域，具体结构取决于平台
- tile 每一次测序荧光扫描的最小单位
- read 指一次读取获得的序列，复数为 reads
- bp base pair 碱基对，用于衡量序列长度
- 双端测序 指从同一插入片段的两端分别读取，例如一个 500 bp 的插入片段两端各读 150 bp
- 未读取区间 在上述例子中，中间还有约 200 bp 未被两端的 reads 覆盖；这段区间不称为 junction。RNA 比对中的 splice junction 通常指剪接连接位点
- adapter 建库时连接到片段两端的人工序列，包含测序引物结合位点等功能元件
- primer PCR 或测序反应中的引物
桥式 PCR 与簇生成
单分子发出的荧光太弱，无法直接检测，因此测序前要先在流动槽表面把每个模板扩增成“簇”。将调整到合适浓度的 DNA 文库加入 flowcell，文库片段末端的 adapter 与流动槽表面固定的寡核苷酸互补配对，通过共价连接固定。随后开始桥式 PCR：第一轮扩增把单链补成双链；加入 NaOH 碱性溶液变性、洗脱——由于最初的连接是共价键，模板不会被洗掉；再加入缓冲液，序列自由端与表面相邻的寡核苷酸配对，弯成“桥”状进行一轮扩增。如此循环，每个原始分子就扩增成一个由完全相同序列组成的簇（cluster）。
这样，整个 flowcell 上就形成了一个个彼此独立的 cluster。测序时，每个 cluster 作为一个“单分子”参与信号读取，二代测序便可以同时读取大量序列。
边合成边测序（SBS）
测序时，聚合酶沿模板延伸引物，加入带有可逆终止基团的核苷酸，使一轮反应只延伸一个碱基。仪器根据荧光信号判断本轮加入的碱基，再解除终止并进入下一轮。不同代际平台的荧光编码和化学体系有所不同，不能都理解为四种碱基各自发出一种颜色。
Illumina 边合成边测序（Sequencing by Synthesis，SBS）的关键是可逆终止子核苷酸：先暂时封闭核苷酸的 3′ 羟基，让链在掺入一个碱基后停下来；读出信号后再解除封闭，恢复下一轮延伸所需的 3′-OH。早期四通道体系还在碱基上连接可切除的荧光染料。下面先看测序过程，本节末的拓展阅读框再用一个早期化学实例解释这两处修饰。
以早期四通道体系为例，每轮循环包含三步：聚合酶掺入一个带荧光标记的可逆终止子，仪器扫描 cluster 并记录信号，随后去除染料并解除 3′ 封闭，再进入下一轮。一个 cluster 中的模板拷贝理想情况下同步延伸，因此这一轮的信号主要对应同一种碱基；仪器逐 tile 扫描，把连续多轮信号转换为碱基序列。染料编码与脱保护条件取决于所用化学体系，不能把一个历史实例的试剂配方套到所有平台。
图 3.8 采用早期 Solexa/Illumina 专利中的一个 dCTP 实例。先沿着脱氧核糖看三个位置：5′ 端连着三磷酸，1′ 位与胞嘧啶的 N1 相连，3′ 位的羟基则被暂时封闭。碱基的 C5 位另接一条含二硫键的连接子，末端连接染料。图中将染料部分简写为 Dye；这是关键结构图，并未展开完整染料分子。可打开原尺寸结构图查看各处键线。
- 为什么每轮只加入一个碱基？ 该实例的 3′ 位带有 –O–CH₂–N₃，即 3′-O-叠氮甲基。聚合酶把核苷酸接到正在延伸的 DNA 链后，新链末端没有可供下一次反应的游离 3′-OH，延伸便暂时停止。
- 为什么还能继续测下一个碱基？ 成像之后，以 TCEP 为例的还原处理可使叠氮甲基经 Staudinger 型反应脱除，恢复 3′-OH；连接子中的二硫键也可以被还原，从碱基上切除染料。糖上的封闭被解除，而碱基上仍可留有一段连接子残基，不能把整个核苷酸说成恢复了天然结构。
- 三磷酸去了哪里？ 图 A 画的是尚未掺入的底物。聚合反应保留与糖相连的 α 磷酸形成磷酸二酯键，另外两个磷酸以焦磷酸形式释放；图 B 的链末端因此不再带着完整三磷酸。
这里要理解的是“暂停延伸—识别信号—恢复延伸”的机制。不同代际试剂的染料、连接子、封闭基团与处理条件可以变化，不能仅从光学通道数判断分子的化学结构。
早期 Illumina 平台四种碱基各带一种染料，需要四个光学通道。NovaSeq 等新平台改用两色编码：G 不带染料（“暗碱基”），一个碱基带双染料，其余两种各带一种染料——例如 NovaSeq 6000 上 A 为红绿双染、C 红、T 绿、G 暗；NovaSeq X/XLEAP 化学则改为蓝绿双通道，C 为双染。减少通道可以提高成像速度和密度，代价是需要靠“有无信号”的组合来推断碱基，对信号质量的要求更高。
读长的限制：phasing 与 pre-phasing
Illumina 单端读长通常不超过 300 bp，主要有两方面原因。
第一，测序循环中不同模板链的延伸会逐渐失去同步，即 phasing（落后：本该加的碱基没加上）与 pre-phasing（超前：一轮加了不止一个碱基）。通俗地讲，一个 cluster 起初是 100 条完全相同的链；某轮如果 99 条加了碱基、1 条没加，整体信号仍是那种颜色，还能正确判断；但随着循环数增加，不同步的链越来越多，杂信号越来越强，最后可能出现“50 红 50 绿”，无法判断到底是哪种碱基。造成 phasing 的主要原因是部分链没有正常延伸（如聚合酶活性下降）；pre-phasing 则可能来自可逆终止基团提前脱落或不完全终止。
第二，测序使用的核苷酸带有很大的荧光修饰基团，聚合酶长时间反应后活性下降；实际读长还受化学稳定性、信号质量和解码方法等因素影响，不能把所有平台归为同一种“荧光淬灭原理”。
相比之下，Sanger 测序的每条序列独立反应、独立电泳读出，不受 cluster 同步性限制，因此单条序列可以读到 500 bp 以上。
3.4 MGI 测序技术
MGI 是另一个主流短读长平台。我们来看它怎样生成信号并读取序列。
华大智造测序仪
华大智造（MGI）的 DNBSEQ 技术同样实现大规模并行短读长测序，但簇生成和测序化学与 Illumina 不同。
文库片段先环化，再通过滚环复制（rolling circle replication）反复复制同一个环状分子，形成由大量相同拷贝组成的 DNA 纳米球（DNB，DNA Nanoball）。这一步是溶液中的线性扩增：每轮复制都从原始环重新读取，复制错误不会像链式反应那样指数放大。制备好的 DNB 被加载到芯片上规则排列的结合位点，每个位点只容纳一个纳米球，形成规则阵列。
测序采用 cPAS（联合探针锚定聚合测序）：每轮反应中加入带荧光的可逆终止 dNTP，在锚定探针和聚合酶的作用下延伸一个碱基并成像，随后清除荧光、解除终止进入下一轮。reads 输出同样是 FASTQ 格式，与 Illumina 数据的下游分析流程高度兼容。
常见机型覆盖不同通量：DNBSEQ-T7 与 T20×2 面向超大人群测序，MGISEQ-2000/DNBSEQ-G400 等常用于科研与临床。选型时同样应查对应型号的实际参数，而不是凭印象套用其他平台的数字。
3.5 长读长测序：PacBio 与 Nanopore
短读长有哪些不足，长读长技术又能提供什么数据？
短读长 reads 难以跨越重复序列、结构变异和全长转录本，这时需要长读长技术。与短读长平台不同，长读长测序不依赖簇扩增，而是直接读取单个分子。
PacBio：SMRT 测序与 HiFi 读长
PacBio 的 SMRT（Single Molecule Real-Time）测序把单个聚合酶固定在零模波导孔（ZMW）底部，四种带不同荧光染料的 dNTP（染料标记在磷酸链上，掺入后自动脱离，因此不需要可逆终止）逐个掺入，实时记录荧光脉冲序列（ 图 3.10 ）。聚合酶可以连续合成，单条读长可达数十 kb。
SMRT 的单遍错误率较高（约 10% 量级），但错误基本随机分布。HiFi 测序利用这一点：把同一分子环化后反复读取（至少 3 遍），对多次读取取一致序列，得到既长（15—25 kb）又准（Q30 以上）的 HiFi reads。PacBio 适合解决结构变异、高度重复或复杂区域，以及通过 Iso-Seq 获得全长转录本。
Nanopore：纳米孔电流测序
Oxford Nanopore 的原理完全不同：马达蛋白牵引单链 DNA（或 RNA）穿过嵌在膜上的纳米孔，不同碱基组合对孔道电流的阻滞不同，仪器连续记录电流变化，再由碱基识别算法（basecalling）把电信号翻译成序列（ 图 3.11 ）。它不依赖合成反应，读长理论上只受样品 DNA 长度限制，可达数百 kb 至 Mb 级；设备从掌上 MinION 到高通量台式机都有，可以现场快速测序。
纳米孔的单遍错误率历史上约 5%—10%，且存在非随机的系统偏差；随着化学体系与识别算法改进（如 Q20 化学和新版 basecaller），精度持续提升。它还能对 RNA 直接测序（不经过逆转录），保留碱基修饰信息，这是其他平台做不到的。
长读长 RNA 测序
常规短读长 RNA-seq 通常先把 RNA 逆转录成 cDNA，再构建文库（流程详见第 5 章）。一个转录本被拆成许多短片段后，需要根据这些片段推断原有结构。长读长技术可以减少这方面的困难，因此特别适合用来理解转录本异构体。
PacBio 的 SMRT 测序观察聚合酶合成 DNA 时的荧光信号。Iso-Seq 分析的是由 RNA 逆转录得到的全长 cDNA，不能称为直接 RNA 测序。Oxford Nanopore 则根据核酸链通过纳米孔时的电流变化推断序列，既有 cDNA 测序，也有直接 RNA 测序；其常用平台不依靠外切酶逐个切下碱基再读取。
长读长、准确度、通量和定量性能需要结合具体平台、化学版本和建库方案讨论，不能只用某一代平台的单一数值来概括。PacBio、Nanopore 和直接 RNA 测序的进一步比较、示例数据与练习待完善。
3.6 高通量文库构建
理解文库结构，才能解释 reads 里为什么会有接头和 index。
建库的基本流程
短读长测序每次只能读取有限长度，因此需要先把待测核酸制成适合平台的文库。下面以片段化的 DNA 文库为例：先把较长的 DNA 打断，再通过片段筛选控制长度分布。本书以 300—500 bp 的插入片段举例；实际范围应按建库方案、读长和研究目的确定。
打断后的片段末端往往不平整，需要先用酶补平，再在 3′ 端用酶加上一个特异的碱基 A。此后利用 A 与末端 T 的互补配对，把 adapter 连接到片段两端。
接头（adapter）的结构与作用
adapter 中文常译为适配器或接头，是建库时连接到片段两端的人工序列。它不只是“一段引物”，而是一组功能元件的组合：与 flowcell 表面寡核苷酸互补配对的序列（P5/P7）、桥式 PCR 所需的引物结合位点、测序引物结合位点，以及样本标签（index）位点。
一个典型的双端索引文库结构是：
P5 — adapter1（含 i5 index 位点）— fragment — adapter2（含 i7 index 位点）— P7测序时加入的引物与 adapter 中专门的测序引物结合位点配对；index 序列由独立的 index read 单独读取，并不出现在 R1/R2 的 reads 里。这里要分清 adapter 与 primer：adapter 是连接在分子上的固定序列，primer 是反应时外加的寡核苷酸，二者靠互补配对起作用。
index 与多样本混合上机
一条 lane 的测序能力往往远大于一个样本的需要（早期的 HiSeq 2000/2500 一条 lane 约 30G；如今一条 lane 的产出从几 Gb 到数 Tb 不等，随机型差异极大）。为充分利用通量并节约成本，建库时给每个样本的接头加上不同的标签序列，即 index（也称 barcode）。多个文库可以混合上机（multiplexing），测序后再按 index 把数据拆分回各自的样本。因此拿到数据时，除了 R1/R2，通常还会得到 index read 的 fastq 文件。
测穿与 read 3′ 端的接头序列
read1 从 insert 的一端向内测序。当插入片段比读长短时，聚合会“测穿”片段、读到另一端的 adapter，因此 adapter 序列总是出现在 read 的 3′ 端。这正是后续质控中“Adapter Content”模块要检测的内容：如果大量 reads 的 3′ 端出现接头，说明文库插入片段偏短或测序读长过长，比对前必须去除。
3.7 测序数据的存储：FASTA 与 FASTQ
能够逐行读懂原始序列文件并解释碱基质量。
测序得到的原始数据以 FASTQ 格式储存，纯序列则常用 FASTA 格式。本节先认识这两种文件格式，再解释其中质量值的编码方式。
FASTQ：一条读段的四行记录
FASTQ 文件每 4 行记录一条 read：
- 第 1 行以
@开头，储存这条 read 的名称和测序坐标等信息； - 第 2 行是测序得到的碱基序列，一般用 A、T、C、G、N 表示，N 代表该位置荧光信号无法判断碱基种类；
- 第 3 行以
+开头，可以储存附加信息，目前的测序数据这一行一般是空的； - 第 4 行是质量字符串，与第 2 行的碱基一一对应，每个字符编码对应位置碱基的测序质量，值越大质量越好。
第 1 行的一个典型例子是 @ST-E00126:128:HJFLHCCXX:2:1101:7405:1133，冒号分隔的各字段含义如下：
| 字段 | 示例 | 含义 |
|---|---|---|
| 标记 | @ |
read 名称行的起始符号 |
| 设备名 | ST-E00126 |
测序仪（设备）名称 |
| 运行号 | 128 |
run（运行）编号 |
| 流动槽 | HJFLHCCXX |
flowcell 编号 |
| 泳道 | 2 |
lane 的编号 |
| 扫描区 | 1101 |
tile 的编号 |
| X 坐标 | 7405 |
在 tile 中的 X 坐标 |
| Y 坐标 | 1133 |
在 tile 中的 Y 坐标 |
实际拿到手的 Illumina 数据通常是 .fastq.gz：gz 表示用 gzip 压缩，fastq 表示用 FASTQ 格式存储。双端测序每个样本会有 R1、R2 两个文件（可能还有 index 文件），两者中同名 read 互为配对。
碱基质量与 Phred 编码
质量字符串的每个字符都是 ASCII 字符，其质量值等于 ASCII 十进制值减去一个固定偏移。同一字符在不同偏移下含义不同，历史上常见的两种编码是 Phred+33 与 Phred+64：
\[ \begin{aligned} \operatorname{Phred}_{33}(\text{F}) &= 70-33=37 \\ \operatorname{Phred}_{64}(\text{F}) &= 70-64=6 \end{aligned} \](3.1)
也就是说，同样的字符 F，在 Phred+33 文件里代表质量值 37，在 Phred+64 文件里代表质量值 6，相差整整 31。下表覆盖全部 128 个 ASCII 字符（编号 0—127）：左半组为 0—63、右半组为 64—127。质量字符串只会使用可打印字符（33—126），因此控制字符（0—31、127）两列 Q 值均记为“—”；Phred+64 编码历史上只用到 105（Q41）。
| 十进制 | 字符 | Phred+33 的 Q 值 | Phred+64 的 Q 值 | 十进制 | 字符 | Phred+33 的 Q 值 | Phred+64 的 Q 值 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0 | NUL | — | — | 64 | @ |
31 | 0 |
| 1 | SOH | — | — | 65 | A |
32 | 1 |
| 2 | STX | — | — | 66 | B |
33 | 2 |
| 3 | ETX | — | — | 67 | C |
34 | 3 |
| 4 | EOT | — | — | 68 | D |
35 | 4 |
| 5 | ENQ | — | — | 69 | E |
36 | 5 |
| 6 | ACK | — | — | 70 | F |
37 | 6 |
| 7 | BEL | — | — | 71 | G |
38 | 7 |
| 8 | BS | — | — | 72 | H |
39 | 8 |
| 9 | HT | — | — | 73 | I |
40 | 9 |
| 10 | LF | — | — | 74 | J |
41 | 10 |
| 11 | VT | — | — | 75 | K |
42 | 11 |
| 12 | FF | — | — | 76 | L |
43 | 12 |
| 13 | CR | — | — | 77 | M |
44 | 13 |
| 14 | SO | — | — | 78 | N |
45 | 14 |
| 15 | SI | — | — | 79 | O |
46 | 15 |
| 16 | DLE | — | — | 80 | P |
47 | 16 |
| 17 | DC1 | — | — | 81 | Q |
48 | 17 |
| 18 | DC2 | — | — | 82 | R |
49 | 18 |
| 19 | DC3 | — | — | 83 | S |
50 | 19 |
| 20 | DC4 | — | — | 84 | T |
51 | 20 |
| 21 | NAK | — | — | 85 | U |
52 | 21 |
| 22 | SYN | — | — | 86 | V |
53 | 22 |
| 23 | ETB | — | — | 87 | W |
54 | 23 |
| 24 | CAN | — | — | 88 | X |
55 | 24 |
| 25 | EM | — | — | 89 | Y |
56 | 25 |
| 26 | SUB | — | — | 90 | Z |
57 | 26 |
| 27 | ESC | — | — | 91 | [ |
58 | 27 |
| 28 | FS | — | — | 92 | \ |
59 | 28 |
| 29 | GS | — | — | 93 | ] |
60 | 29 |
| 30 | RS | — | — | 94 | ^ |
61 | 30 |
| 31 | US | — | — | 95 | _ |
62 | 31 |
| 32 | 空格 | — | — | 96 | ` |
63 | 32 |
| 33 | ! |
0 | — | 97 | a |
64 | 33 |
| 34 | " |
1 | — | 98 | b |
65 | 34 |
| 35 | # |
2 | — | 99 | c |
66 | 35 |
| 36 | $ |
3 | — | 100 | d |
67 | 36 |
| 37 | % |
4 | — | 101 | e |
68 | 37 |
| 38 | & |
5 | — | 102 | f |
69 | 38 |
| 39 | ' |
6 | — | 103 | g |
70 | 39 |
| 40 | ( |
7 | — | 104 | h |
71 | 40 |
| 41 | ) |
8 | — | 105 | i |
72 | 41 |
| 42 | * |
9 | — | 106 | j |
73 | — |
| 43 | + |
10 | — | 107 | k |
74 | — |
| 44 | , |
11 | — | 108 | l |
75 | — |
| 45 | - |
12 | — | 109 | m |
76 | — |
| 46 | . |
13 | — | 110 | n |
77 | — |
| 47 | / |
14 | — | 111 | o |
78 | — |
| 48 | 0 |
15 | — | 112 | p |
79 | — |
| 49 | 1 |
16 | — | 113 | q |
80 | — |
| 50 | 2 |
17 | — | 114 | r |
81 | — |
| 51 | 3 |
18 | — | 115 | s |
82 | — |
| 52 | 4 |
19 | — | 116 | t |
83 | — |
| 53 | 5 |
20 | — | 117 | u |
84 | — |
| 54 | 6 |
21 | — | 118 | v |
85 | — |
| 55 | 7 |
22 | — | 119 | w |
86 | — |
| 56 | 8 |
23 | — | 120 | x |
87 | — |
| 57 | 9 |
24 | — | 121 | y |
88 | — |
| 58 | : |
25 | — | 122 | z |
89 | — |
| 59 | ; |
26 | — | 123 | { |
90 | — |
| 60 | < |
27 | — | 124 | | | 91 | — |
| 61 | = |
28 | — | 125 | } |
92 | — |
| 62 | > |
29 | — | 126 | ~ |
93 | — |
| 63 | ? |
30 | — | 127 | DEL | — | — |
那质量值 Q 本身是什么？它是错误概率的函数：
\[ Q=-10\log_{10}P \](3.2)
其中 P 是该碱基被判读错误的概率（Probability of incorrect base call）。Q 值为 40 代表错误概率 0.0001；为 30 代表 0.001；为 20 代表 0.01；为 10 则代表 0.1。把 Q 加上偏移量（33 或 64），再取对应的 ASCII 字符，就得到 FASTQ 第四行的质量字符串；反过来，读文件时用字符的十进制值减去偏移量即恢复 Q 值。
早年 Solexa 系列仪器使用过另一种以错误几率定义的质量：
\[ Q_{\text{Solexa}}=-10\log_{10}\frac{P}{1-P} \](3.3)
它在错误率较高时与 Phred 定义差别明显，低错误率时两者趋于一致。实际数据处理中需要注意编码历史：近年产生的数据基本都采用 Phred+33；从 NCBI SRA 下载的早期数据可能是 Phred+64 或 Solexa 编码，交给软件处理时要正确指定，例如 cutadapt 的 --quality-base=64 参数。
FASTA：存储纯序列
FASTA 格式用于储存纯序列信息，可以放 DNA、RNA 和蛋白质序列。第 1 行以 > 开头，是序列描述；从第 2 行起是序列本身。描述行的字段因数据库而异，下面是两个常见例子（UniProt 蛋白质记录与 GenBank mRNA 记录；mRNA 序列中的 U 在文件里写作 T）：
>sp|P69905|HBA_HUMAN Hemoglobin subunit alpha OS=Homo sapiens GN=HBA1
MVLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHLPAEFTPAVHASLDKLASVSTVLTSKYR>gi|13650073|gb|AF349571.1| Homo sapiens hemoglobin alpha-1 globin chain (HBA1) mRNA, complete cds
CCCACAGACTCAGAGAGAACCCACCATGGTGCTGTCTCCTGACGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGTGGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCACGCGCACAAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTCCCCGCCGAGTTCACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTAAGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTTGFASTA 与 FASTQ 的适用场景
只关心序列本身时用 FASTA，参考基因组、转录本序列和蛋白质序列都以此发布。需要同时保留每个碱基的测序质量时用 FASTQ，测序仪下机数据、交给比对和质控软件的原始数据都是 FASTQ。因此，FASTA 描述“序列是什么”，FASTQ 还记录“每个碱基测得多准”。
3.8 质量评估：FastQC 与 MultiQC
解读质控图时，需要结合实验背景，不能只看报告中的红绿灯。
质量控制包括什么
测序原始数据以 FASTQ 格式存储，包含序列信息和碱基质量。测序过程中存在样本污染或降解、接头污染以及不可避免的测序误差等干扰因素，都会影响数据质量。质量控制的目的，一是评估数据质量、判断能否进入后续分析，二是获得高质量的测序片段。质量控制包括测序质量评估和高质量测序片段的获取两部分。
质控不能等到分析失败才做：拿到数据的第一步就应运行质控软件，先了解数据“长什么样”，再决定用什么参数处理。
FastQC：运行与结果总览
FastQC 是最常用的 FASTQ 质量评估软件（ 图 3.14 ）。命令行运行方式示例：
fastqc -t 4 -o fastqc_result sample_R1.fastq.gz sample_R2.fastq.gzFastQC 会对每一个输入文件生成一个 html 网页和一个 zip 压缩包（内含网页中的图片），日常只需要看网页里整理好的内容。它对碱基质量、接头序列、重复序列、GC 含量、N 含量、长度分布等逐项统计，并给出模块级别的判定：
- 基本统计（Basic Statistics）
- 每个位置的碱基质量（Per base sequence quality）
- 每条 reads 的质量分布（Per sequence quality scores）
- 每个位置上四种碱基的比例（Per base sequence content）
- 每条 reads 的 GC 含量分布（Per sequence GC content）
- 每个位置不明碱基 N 的含量（Per base N content）
- 长度分布（Sequence Length Distribution）
- 序列的重复水平（Sequence Duplication Levels）
- 突出的重复序列（Overrepresented sequences）
- 接头序列情况（Adapter Content）
- 特定短序列（k-mer）的富集情况（Kmer Content）
软件对每一项给出判定：绿色对勾代表 pass，黄色叹号代表 warn，红色叉代表 fail。判定只针对“随机文库”这一默认假设，评估为 warn 或 fail 不代表样品一定不能用，必须结合具体测序对象解读。
基本统计模块汇总文件类型、编码方式、总 read 数、GC 含量和序列长度等，能最快了解样本概况（ 图 3.15 ）。
下面逐模块解读最常看的几张图。
逐碱基序列质量（Per base sequence quality）
横轴是 read 中的位置（第 1 到第 150 个碱基），纵轴是每个位置所有碱基的质量值（ 图 3.17 ）。每个位置画一个箱线图：上下横线分别是 90% 和 10% 分位数，箱体上下缘是 75% 和 25% 分位数，箱中横线是中位数；蓝色细线连接各位置的平均质量。分位数的直观解释：若一组数的 25% 分位数是 a，意味着 a 超过了这组数中 25% 的值。判读阈值：任一位置的下四分位数低于 10 或中位数低于 25 时评估为 warn；低于 5 或 20 时评估为 fail。
双端数据要把 R1 与 R2 分开看。下面两张图来自同一次测序（ 图 3.18 与 图 3.19 ），reads2 的质量均匀性明显差于 reads1。结合本章 3.3 节的原理来看：reads1 的 150bp 测序完成后，要先重新合成互补链，再对 reads2 进行荧光测序。此时合成酶经过长时间反应，活性已经下降，部分链加不上碱基，cluster 内的同步性变差，主要表现为 phasing 错误累积、箱体整体下移、离群点增多。
碱基组成（Per base sequence content）
横轴同样是 read 中的位置，纵轴是每个位置 A、T、C、G 各自的百分比（ 图 3.20 ）。随机文库中每个位置四种碱基的比例应大致相等（Chargaff 法则），四条线应当平行地贴着 25%。判读阈值：任一位置 A 与 T 的比例之差、或 G 与 C 的比例之差超过 10% 评估为 warn，超过 20% 评估为 fail——比较的是互补碱基之间的差值，而不是 A/T 与 G/C 两个比值之间的差。
开头几 bp 出现波动是普遍现象，主要原因是建库引入的序列偏好：RNA-seq 的随机六聚体引物、转座酶片段化都会造成对起始位置的选择偏好。FastQC 官方文档指出，这类文库在约前 12bp 普遍存在偏差，多数 RNA-seq 样本在这一模块都会触发警告，一般不影响下游分析，也无法靠 trim 消除。如果测序质量得分很高，可以不 trim 开头部分；只有得分也差时才考虑 trim。
DNA 全基因组测序样本通常呈现“前 10bp 左右波动、之后四线平稳”的形态（ 图 3.21 ），平稳区的四条线可以用来读出该物种的 GC 含量——图中 GC 合计约 42%，与人类基因组的已知值一致。GC 含量在同一物种内是相当稳定的量，不同物种间通常不同。
如果四条线全程剧烈波动（ 图 3.22 ），说明文库测到的分子群体碱基组成不随机——例如特殊建库富集的 RNA 群体。再如 图 3.20 的小 RNA 样本：文库测到的是 miRNA 等特定的小 RNA 分子，其群体碱基组成本身不随机（例如 miRNA 的第 1 位碱基多为 U），四线不平行、AT 占比偏高属于正常现象。
每序列 GC 含量分布（Per sequence GC content）
这个模块换了一个视角：对每条 read 计算整体 GC 含量，画所有 reads 的分布曲线（ 图 3.23 ）。横轴是 GC 含量（0—100%），纵轴是具有相应 GC 含量的 reads 数量；蓝色虚线是根据数据拟合的理论正态分布。随机文库的曲线应是与蓝线基本重合的单峰，峰的位置就是该物种基因组的 GC 含量。
当曲线出现异常形态时需要追问原因。 图 3.24 的曲线出现双峰且偏离理论分布，最常见的解释是混入了其他物种的 DNA（污染），也可能是 rRNA、接头序列或 PCR 过度扩增等造成。
遇到 GC 分布双峰时，可以按下面的思路排查：
- 先把 reads 比对到目标参考基因组，统计 mapping rate；如果比例非常低，说明污染严重，数据基本不可用。
- 如果大部分 reads 比对成功，可把未比对的 reads 拿去做 blast，确认混入的是哪些物种的序列，过滤掉这部分 reads 后一般不影响后续分析。
参考解答要点： 关键量是 mapping rate——它把“分布形状异常”转化为“有多少数据属于目标物种”的可量化判断。
序列长度分布（Sequence Length Distribution）
横轴是序列长度，纵轴是相应长度 reads 的数量（ 图 3.25 ）。刚下机的 Illumina 数据所有 reads 长度一致（如双端 150bp），因为测序循环数固定，图中应是一个尖峰。经过 cutadapt 等工具去除接头后，reads 的长度就会有所不同：有些 insert 被测穿，有些没有，被切掉的长度也不相同。因此，处理后的数据出现长短不一的 reads，通常是正常现象。
重复序列水平（Sequence Duplication Levels）
这个模块统计完全相同（或高度相似）的序列在文库中出现的次数分布：横轴是重复级别（唯一、重复 2 次、重复 3—4 次……），纵轴是相应 reads 的比例。随机片段化的文库应以唯一序列为主；如果高重复级别的比例异常，通常意味着文库复杂度低——样本投入量不足、PCR 扩增轮数过多，或文库本身来源分子有限（如靶向富集、单细胞）。
判定时要区分“重复的原因”。对常规 RNA-seq，duplication 主要来自转录本表达量的天然差异和文库构建，一般不做去重，直接去除反而会破坏表达定量。但对于 PCR 轮数很多的特殊建库（如单细胞 RNA-seq），大量 duplication 是扩增假象，这时需要在建库时加入 random barcode（现在常称 UMI，唯一分子标识符），按 UMI 区分“来自不同原始分子的相同序列”与“同一分子的 PCR 拷贝”，只对后者去重。
接头含量（Adapter Content）
横轴是 read 中的位置，纵轴是相应位置含某种接头序列的 reads 百分比，不同颜色对应不同的通用接头（ 图 3.26 、 图 3.27 ）。正常文库只有少量 reads 在 3′ 端测穿进入接头；如果 read 后半段接头比例很高（如 图 3.27 ），说明文库插入片段普遍偏短或存在建库问题，必须去除接头才能比对。
统计默认使用的通用接头序列如下（序列中的 * 表示硫代磷酸键修饰，并不是笔误）：
Illumina Paired End Adapters (cannot be used for multiplexing)
Top adapter
5′ ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T 3’
Bottom adapter
5′ P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG 3’来源：Illumina adapter and primer sequences（CVR 生物信息博客）。如果在运行 FastQC 时没有用 --adapters 选项（旧版本为 -a）指定接头文件，则默认按图例中的通用接头序列统计。
K-mer 含量（Kmer Content）
k-mer 指定长的短序列，例如 AATTCCGG 是一个 8-mer。该模块统计每个 7-mer 在 read 各位置的出现频率：横轴是 read 中的位置，纵轴是在对应位置含有该 k-mer 的 reads 百分比，每条线代表一个出现富集的 k-mer（ 图 3.29 ）。正常文库的短序列不应偏好特定位置；某条线在固定位置明显抬升，说明存在系统性来源——接头、随机引物偏好，或建库时加入的固定序列。
图 3.30 中 kmer 在 read 开头集中富集，原因是建库时在 5′ 端加入了约 10bp 的 random barcode（UMI）——这段固定位置的随机序列本身造成了 kmer 富集，与 图 3.31 的统计表互相印证。表中各列依次是：kmer 序列、该 kmer 在整个文库中被观测到的总次数（Count）、二项分布检验的 P 值、观察值与期望值之比的最大值（Obs/Exp Max）、以及该最大值出现的位置（Max Position）。FastQC 采样约 2% 的 reads 进行统计，序列超过 500bp 时只分析前 500bp。
如何计算 human genome 19（hg19）每一条染色体的 GC 含量？
参考解答：
思路一：从 UCSC 或 Ensembl 下载 hg19 染色体序列，写 Python 程序依次读取每条序列、统计每条染色体的 GC 含量。
思路二：直接使用现成工具按染色体统计碱基组成，再换算 GC 比例。
两种思路都要注意：线粒体染色体（chrM）长度很短且 GC 含量与核染色体差别大，单列统计更容易发现异常。
MultiQC：多样本汇总
实际项目往往一次产出几十上百个样本，逐个打开 FastQC 网页不现实。MultiQC 会扫描指定目录下 FastQC、cutadapt、比对软件等工具的输出，把所有样本的关键指标汇总成可排序的报告表和总览图，例如各样本的数据量、质量趋势、接头比例、mapping rate。常用命令：
multiqc fastqc_result/ -o multiqc_report看报告时，先找出整体比较中异常的样本，再打开相应的 FastQC 报告细看原因。实际项目中，通常将这两种报告配合使用。
3.9 数据清理：去接头与低质量序列
清理数据时，要确定哪些序列需要修剪，保持双端 reads 的配对关系，并检查处理效果。
为什么要清理以及常用工具
质控报告确认数据可用后，进入获取高质量 reads 的步骤。需要清理的内容包括：低质量碱基或 reads、含 N 过多的序列，以及接头序列——用于区分样本的 barcode（index）序列、建库 PCR 扩增所需的引物结合序列，以及与 flowcell 表面寡核苷酸互补配对的序列。这些序列不存在于基因组上，不切除会显著拉低比对率。
常用工具各有侧重。Trimmomatic 的滑动窗口（SLIDINGWINDOW）从 read 一端评估窗口内碱基质量均值，低于阈值时从该处切除后续碱基（配合最低长度参数可丢弃过短 read），还支持接头去除、去除 reads 3′/5′ 端指定长度或低质量碱基。Cutadapt 偏重接头处理：去除 reads 内部或两端的接头，可设置接头错配率、允许接头含 indel、支持通配碱基，也能过滤含 N 过多和低质量的 reads。fastp 把去接头、质量裁剪和报告生成合并为一步完成，是目前快速流程的常见选择。
Fastx-toolkit 与 NGSQC 是早期常用工具，已长期停止维护。本书保留它们的示例，用于理解处理思路和练习。如今的同类操作更常用 Cutadapt、fastp、Trimmomatic（仍在维护）以及 seqtk、seqkit 等。
cutadapt：接头去除的参数
cutadapt 支持单端和双端数据，也支持 gz 格式的自动压缩与解压缩。双端去除接头的常用命令：
cutadapt -a ADAPTER_FWD -A ADAPTER_REV -o out.1.fastq -p out.2.fastq reads.1.fastq reads.2.fastq参数含义：-a 是 read1 3′ 端要去除的接头；-A 是 read2 3′ 端要去除的接头；-o、-p 分别是两端输出文件；最后是两个输入文件。-g/-G 的用法与 -a/-A 类似，但对应 5′ 端接头——常规 Illumina 文库 5′ 端不会测出接头，所以很少用到。
-m 参数指定最小保留长度：切完接头后短于该长度的 read 直接舍弃，因为过短的序列无法可靠比对。-q 参数用于质量裁剪，见下文。
cutadapt：3′ 端质量裁剪的算法
测序中常见 read 的 3′ 端质量较差（例如逐碱基质量图中 3′ 端箱体逐渐下移）。-q 参数可以在去接头的同时切掉低质量末端，例如：
cutadapt -q 10 -o output.fastq input.fastq-q 后的数字是质量阈值，低于该值的碱基将被切除；若文件采用 Phred64 编码，需加 --quality-base=64。
cutadapt 会考虑整个低质量区域，允许其中夹杂质量较好的碱基，再寻找整体最优的切点，并非遇到第一个低质量碱基就停止。以一条 13bp、阈值 10 的 read 为例：
A T G C C G T A C C G G T
42 42 41 41 40 26 27 8 7 11 4 2 3第一步，每个质量值减去阈值：
32 32 31 31 30 16 17 -2 -3 1 -6 -8 -7第二步，从 3′ 端向 5′ 端累加，得到每个位置到末尾的累加和：
164 132 100 69 38 8 -8 -25 -23 -20 -21 -15 -7cutadapt 的规则是取累加和最小值（−25）出现的位置——第 8 位——作为裁剪位点，保留其前面的碱基：
A T G C C G T --cut here-- A C C G G T这样处理的好处是可以容忍 3′ 端零星的质量回升，不会因为个别碱基质量突然变好而过早停止裁剪。
3.10 其他常用整理操作
seqkit：FASTQ/FASTA 的多功能工具箱
除了去接头和裁剪，日常还经常需要对 FASTQ/FASTA 做统计、筛选、抽样、截取等整理。seqkit 是一个跨平台、多线程的命令行工具箱，直接读写 gzip 文件，所有子命令共享一致的风格：输入文件作为最后一个参数，-j 指定线程数，-o 指定输出（省略时打印到屏幕，便于先预览再落盘）。下面按常见任务分组介绍代表性用法。
统计与格式转换
最常用的是文件级统计，汇总每个文件的 reads 数、长度、GC 含量和 Q20/Q30 比例，是检查数据概况最快的方式之一：
seqkit stats -a *.fastq.gz想先看看文件内容，可以用 head 取前几条记录。它类似 Linux 的 head，但按序列“条数”而不是文本“行数”计数：
seqkit head -n 4 sample_R1.fastq.gzfx2tab 把序列文件转成制表符分隔的表格，-l 加序列长度、-g 加 GC 含量，便于用 sort、awk 等文本工具继续处理；tab2fx 做反向转换：
seqkit fx2tab -n -l -g genome.fa | head -5按名称或序列筛选
grep 按 ID（-n 按完整名称）或序列匹配提取子集，配合 -f 从文件读取模式列表。FASTA 处理的经典场景——从参考基因组里挑出指定染色体：
seqkit grep -n -p chrM genome.fa -o chrM.fa写一个每行一个名称的 ids.txt（-f ids.txt）即可批量提取；FASTQ 同样适用，例如从大文件中挑出关心的 reads。加 -v 反向排除、-r 启用正则表达式，-C 只显示匹配计数。
截取区间与固定长度
subseq 按坐标截取：-r 1:50 取第 1 到 50 位，-r -12:-1 取末尾 12 位，负数坐标从末尾数起。
seqkit subseq -r 1:50 input.fastq.gz -o trim50.fastq.gz需要统一 reads 长度时（例如某些特定分析流程的输入要求），可以先用质量裁剪，再用 subseq 硬截到固定长度——注意“硬截”不管质量，老一代工具中 fastx_trimmer 也做同样的事。
随机抽样
调试流程或做大数据集的快速预览时，常需要抽取一部分 reads：-p 0.1 按比例抽 10%，-n 100000 按条数抽，-s 是随机种子（固定种子保证可重复）：
seqkit sample -p 0.1 -s 11 sample_R1.fastq.gz -o sub_R1.fastq.gz双端数据对 R1、R2 用相同种子分别抽样，即可保持配对关系不变。
序列变换与拆分
seq 对序列本身做变换：-r -p 反向互补、--rna2dna 把 RNA 转成 DNA、-u 统一转大写，建库软件给出的低软遮蔽（小写）序列常需要这一步；-g 去掉比对后序列里的缺口符：
seqkit seq -r -p chrM.fa | seqkit head -n 1需要去重时用专门的 seqkit rmdup（按序列或按名称去除重复记录，-D 统计重复而不删除）。split 把文件拆成多份，-p 4 平均分 4 份，便于并行处理：
seqkit split -p 4 big_R1.fastq.gz综合示例：从参考基因组到 chrM 的 GC 含量
把前面的命令接起来，就可以完成 3.8 节练习里“计算一条染色体 GC 含量”的任务：先用 grep 提取 chrM，再用 fx2tab 输出它的长度与 GC 含量。
seqkit grep -n -p chrM genome.fa | seqkit fx2tab -n -l -g同类工具还有更早的 seqtk（seqtk sample、seqtk trimfq 等）。选择原则是一样的：先明确要做什么，再选工具，用 --help 确认参数含义。
综合练习：等长截取的三步流程
假设你有一个 RNA-Seq 文件需要进行可变剪切分析，要求达到：
- 处理后的 fastq 文件中不包含 adapter 序列；
- 开头 10bp 的 random barcode 需要去掉；
- 最后得到的序列长度完全一致（不满足要求的丢弃）。
输入文件是 input.fastq，系统是 Linux Ubuntu，adapter 序列为 AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT。请参考 cutadapt 与历史工具 fastx_trimmer 的用法，设计处理路线并给出参数。
参考解答： 分三步——先用 FastQC 确认 3′ 端接头与 5′ 端 barcode 的情况；再用 cutadapt 去掉 3′ 端接头并用 -m 保留足够长的序列；最后截掉开头 10bp 并统一到固定长度（fastx_trimmer 的 -f 11 -l 125 表示保留第 11 到 125 位，得到 115bp 的等长序列；现代流程可用 seqkit subseq 完成同样操作）：
# step 1, FastQC
fastqc -q -t 3 -o ./FastQC_result ./input.fastq
# step 2, cut adapter
cutadapt -q 25 -m 125 \
-a AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT \
-o input_cutadapt.fq.gz input.fastq
# step 3, trim
zcat input_cutadapt.fq.gz | fastx_trimmer \
-f 11 -l 125 -z -o ./input_cutadapt_trim11_125.fq.gz
# 经过上述 3 个步骤，可以获得长度统一为 115bp 的序列其中 fastx_trimmer 所属的 fastx_toolkit 是长期停止维护的早期工具，此处保留用于演示流程；实际项目中可用 seqkit subseq -r 11:125 替代第三步。
图片来源：oezratty.net。沿用原稿的来源标注。↩︎
结构依据 US7541444B2，化合物 (18)：C5 位经含二硫键的连接子连接 Alexa Fluor 488 的 3′-O-叠氮甲基 dCTP；图中以 Dye 简写染料部分。早期测序循环参见 Bentley DR, et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 2008;456:53–59. DOI。叠氮甲基脱保护的补充说明见 Guo et al. 2008, PNAS；该文采用的混合 SBS 体系与本图专利实例不同。↩︎
图片来源：Huang J. et al. 2017, GigaScience 6(5), doi:10.1093/gigascience/gix024，CC BY 4.0。↩︎
图片来源：Wang Y. et al. 2025, Biosensors 15(1):4, doi:10.3390/bios15010004，CC BY 4.0。↩︎
图片来源：Nova I.C. et al. 2017, PLoS ONE 12(7):e0181599，CC BY 4.0，经 Wikimedia Commons。↩︎